بررسی اثر miRNA بر نوروپاتوفیزیولوژی بیماری ویروسی (VHS)

دانشگاه شهیدبهشتی

نام دانشجو: نوشین زمان‌نژاد

اساتید راهنما: دکتر محمدرضا بیگدلی (مدیر گروه فیزیولوژی و معاونت بخش علوم اعصاب دانشگاه شهیدبهشتی)

دکتر عباسعلی مطلبی (مشاور سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، استاد بهداشت مواد غذایی واحد علوم و تحقیقات تهران)

اساتید مشاور:

دکتر حمید کهرام (رئیس سابق مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی)

دکتر مریم دادار (بخش بیوتکنولوژی مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی)

چکیده:

بیماری سپتی سمی خونریزی‌دهنده ویروسی ( VHS ) یک بیماری ویروسی حاد بوده که باعث تلفات و مرگ و میر گسترده در ماهی قزل‌آلای پرورشی می‌شود و به‌عنوان نخستین بیماری اخطارکردنی ماهیان قزل‌آلا به‌شمار می‌رود. در حال حاضر بیماری در کشورهای اروپایی، آمریکای شمالی و ژاپن وجود دارد. میزبان اولیه آن قزل‌آلای رنگین‌کمان بوده ولی ویروس از بیش از 90 گونه ماهی جدا شده است. جزو بیماری‌های لیست شده سازمان بهداشت جهانی دام بوده و به نوعی بیماری نخست صنعت پرورش ماهی قزل‌آلا در دنیا است. تأثیرات بیماری بر صنعت قزل‌آلای کشور بسیار سنگین بوده و پیش‌بینی می‌شود تا 25 درصد تولید قزل‌آلا در کشور‌ افت کند. به‌دلیل اهمیت فراوان این بیماری ویروسی‌ در بروز تلفات و خسارات سنگین اقتصادی در ماهی قزل‌آلا و با توجه به اینکه بیماری مسری و قابل انتقال است، تشخیص دقیق و به موقع این بیماری و درمان، از اولویت بالایی برخوردار خواهد بود. همه ساله به دلیل عدم تشخیص دقیق و به موقع درکشور شاهد ضررهای اقتصادی جبران ناپذیری هستیم که می‌توان با شناسایی مطمئن و دقیق کانون‌های آلوده در کشور و تأیید وقوع بیماری مورد نظر، بلافاصله به مهار و کنترل آن اقدام کرد و با کمک برنامه‌های ریشه‌کنی و کنترلی قرنطینه‌ای و درمان، در خصوص این بیماری از شیوع آن جلوگیری به عمل آورد. تاکنون روش درمان قطعی برای بیماری پیدا نشده، بنابراین در این تحقیق احتمال استفاده از miRNA در غیرفعال کردن ویروس عامل بیماری و کنترل بیماری مورد توجه قرار گرفته که موجب امکان جلوگیری از خسارت‌های سنگین سالانه به مزارع پرورش ماهی‌های سردابی کشور به دلیل آلودگی به ویروس VHS خواهد شد. تحقیق حاضر در راستای درمان بیماری در آینده امری ضروری به‌نظر می‌رسد.

اهداف:

اثر miRNA بر استحکام سد خونی مغزی

اثر miRNA بر میزان فعالیت کربنیک آنهیدراز

اثر miRNA بر درصد تلفات ماهی آلوده به ویروس

اثر miRNA بر کاهش تکثیر ویروس

روش انجام آزمایش:

پژوهش در فضای سربسته و کاملا ایزوله در ایستگاه تحقیقات خجیر واقع در پارک ملی خجیر، وابسته به مرکز آموزش و تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان تهران، انجام خواهد شد. برای انجام آزمایش مجموعا 360 عدد ماهی قزل‌آلای 20 گرمی مورد نیاز است که در چهار گروه با سه تکرار طبقه‌بندی می‌شوند. چالش ویروس تنها در دو گروه صورت می‌پذیرد. گروه دوم با miRNA مورد معالجه قرار گرفته و گروه چهارم فقط تزریق ویروس را خواهد داشت.

مدت انجام آزمایش با ماهی زنده حدود 60 روز بوده و نمونه‌ها به جهت انجام آزمایشات‌ Real time PCR ، اسپکتروفتومتری، بافت‌شناسی، کار با میکرسکوپ الکترونی و هیستوشیمی ‌به کار گرفته خواهد شد. عملیات معدوم سازی الباقی ماهی‌ها و ضدعفونی آکواریوم‌های مورد استفاده بنا به پیشنهاد دفتر بهداشت و مدیریت بیماری‌های آبزیان و به استناد قانون سازمان دامپزشکی کشور، مصوب 1350 و آیین نامه‌های مربوط در مردادماه سال 1393 با کد ( IVO/ 93/06 ‌) لازم‌الاجرا بوده و انجام خواهد شد.

مدت زمان بین تخلیه یا معدوم سازی و خشک کردن و ضدعفونی کامل (آیش) آکواریوم‌ها رعایت شده و‌ یادآوری می‌شود که این مدت برای بیماری VHS حداقل یک ماه است. چاهک دفن بهداشتی که چاهکی با حداقل ارتفاع یک متر و قطر دو متر در منطقه‌ای که سطح ایستائی آب زیرزمینی دو برابر عمق چاهک بوده احداث می‌شود. انتقال لاشه‌های معدوم شده به چاه دفن،‌ با ظروف پلاستیکی صورت پذیرفته و آهک زنده به عمق 20 تا 10 سانتی‌متر در کف چاهک دفن ماهیان معدوم شده ریخته خواهد شد. الباقی ماهی‌ها به صورت لایه به لایه با آهک زنده دفن می‌شوند. آهک پاشی به عمق 20 تا 10 سانتی‌متر روی آخرین لایه تلفات انجام شده و خاک به ارتفاع 40 سانتی‌متر روی آخرین لایه آهک اضافه می‌شود.

ریختن آب روی چاهک به میزان حداقل 200 لیتر به صورت تدریجی حداقل در عرض 30 دقیقه انجام شده و ایجاد تمهیدات حفاظتی مناسب برای پوشاندن چاهک با سنگ درپوش و سیمان کاری جهت جلوگیری از دسترسی حیوانات مزاحم چون سگ، گربه یا حیوانات وحشی به لاشه‌های دفن شده صورت می‌پذیرد. لازم به‌ذکر است که دستکاری و تخریب محل چاهک‌های دفن بهداشتی نباید تا 3 ماه صورت پذیرد. استفاده از دستکش حفاظتی مناسب نفوذ ناپذیر و مقاوم به حرارت با لایه کتان و عینک و پوشش محافظ صورت و چکمه و البسه مناسب کار در عملیات دفن بهداشتی ضروری است.

شست‌وشوی آکواریوم‌ها با استفاده از ترکیبات شوینده مجاز به همراه تمیز کردن تمام خلل و فرج موجود در کف و دیواره‌ها با استفاده از برس و آب با فشار قوی و تخلیه کامل آب شست‌وشو به مخزن تعبیه شده جهت ضدعفونی آب و معدوم کردن ویروس احتمالی صورت می‌پذیرد. استفاده از حرارت مرطوب (آب جوشیده)‌ به مدت پنج دقیقه با 100 درجه انجام شده و آکواریوم‌ها در معرض تابش نور خورشید به مدت حداقل یک هفته قرار می‌گیرند. سوزاندن و امحای تمام وسایل یک بار مصرف انجام می‌پذیرد.

هنگام تخلیه آب آکواریوم‌ها، ابتدا از طریق شیرهای تعبیه شده در زیر آکواریوم با شلنگ‌های کاملا ایزوله، آب به مخزن سر بسته پلی‌اتیلن در‌دار هدایت شده و پس از ضدعفونی کامل آب توسط ترکیب هیپوکلریت کلسیم به میزان 40 میلی‌گرم به ازای هر لیتر آب (40 PPM ‌) از لوله ایزوله انتهای مخزن به چاهک اصلی هدایت خواهد شد.

در این پژوهش تمام پروتکل‌های حفاظتی کار با ویروس که توسط سازمان محترم دامپزشکی عنوان شده رعایت می‌شود. انجام این آزمایش با امکان درمان قطعی این بیماری و بررسی نوروپاتوفیزیولوژیک ماهی‌های بیمار، برای نخستین بار با همکاری دانشگاه شهید بهشتی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات و آموزش کشاورزی و مرکز آموزش و تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان تهران و همکاری سازمان دامپزشکی به عنوان اصلی‌ترین سازمان مرتبط با بیماری‌های ویروسی انجام پذیرفته و از این طریق می‌تواند کمک بزرگی به صنعت آبزی پروری کشور، کنترل و ریشه‌کنی بیماری و اهداف سازمان دامپزشکی در راستای کنترل و درمان بیماری ویروسی سپتی‌سمی هموراژیک کند. بدیهی است تمام این تلاش‌ها در جهت ارتقای بهره‌وری و به فرموده مقام معظم رهبری در راستای انجام اقتصاد مقاومتی، اقدام و عمل صورت خواهد پذیرفت./

V-960219-03